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选择典型的饲料原料
浏览: 发布日期:2019-03-19

  本文提供了液相色谱-串联质谱法(LC-MS)检测饲料原料中维生素A、维生素D3、维生素E的方法,该检测方法可以实现维生素A、维生素D3、维生素E的联检,且LC-MS方法灵敏度较高,比现行高效液相色谱法高1000倍以上。LC-MS方法可应用于饲料原料、粮食、农产品、食品等维生素A、维生素D3、维生素E含量很低的样品的检测。该方法在0.1~100IU/L的浓度范围呈现良好的线、维生素E的回收率均达到80.0%~110%,相对偏差不大于15%。

  现行的饲料中维生素A、维生素D3、维生素E(以下简称“VA、VD3、VE”)的检测方法均为液相色谱法,其中VA的检测方法为GB/T 17817-2010,定量限为1000IU/kg;VD3检测方法为GB/T 17818-2010,定量限为500IU/kg;VE的检测方法为GB/T 17812-2008,定量限为1IU/kg。饲料原料中VA、VD3、VE含量在方法的定量限之下时,上述方法无法准确检出它们的含量。虽然饲料原料中VA、VD3、VE的含量很低,但由于饲料原料的添加比例很大,因此饲料中VA、VD3、VE的总量十分很可观,故研究适用于饲料中VA、VD3、VE低含量的检测方法是一件十分有价值的工作。

  1.1.1 皂化反应溶液需先离心:皂化反应后的样液转移至离心管中,离心取上清液转移至分液漏斗中,防止样品残渣堵塞分液漏斗。

  1.1.2 用石油醚代替:石油醚的提取效率和的提取效率基本相同,且因为石油醚的毒性低于,因此用石油醚代替。

  用甲醇溶液配置VA、VD3、VE工作液,其系列浓度分别为0.1IU/L、0.5IU/L、1.0IU/L、5.0IU/L、20.0IU/L、100IU/L。相同条件下,用串联质谱检测上述曲线各点的峰面积,VA的浓度与峰面积的相关系数为0.9998,VD3的浓度与峰面积的相关系数为0.9999,VE的浓度与峰面积的相关系数为0.9995。

  笔者分别考察了乙腈、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、正己烷、甲基异丁酮的洗脱效果,回收率表明:用丙酮做洗脱液,VA、VD3过柱回收率达到100%,VE过柱回收率达到98%,因此选择丙酮做洗脱液。

  用3mL 80%甲醇水溶液活化小柱,适量样液上柱,再用3mL 80%甲醇水溶液淋洗小柱,抽干,3mL丙酮洗脱,50℃氮气吹干,甲醇溶液复溶,过膜,供LC-MS检测。

  本实验采用实验室常用的C18色谱柱,以甲醇、水作为流动相进行研究。由于VA、VD3、VE中含有氮原子和氧原子,易于接受氢质子,因此质谱检测方式选用正离子模式。经实验比较发现,选用C18色谱柱(柱长100mm,内径2.1mm,粒径2.4m)、0.2%甲酸水溶液和甲醇作为流动相,得到的色谱峰对称性好,无拖尾现象,待测物与样品中的杂质分离效果理想。

  液相色谱条件为,色谱柱:C18柱、柱长100mm、内径2.1mm、粒径2.4m;流动相:A相为甲醇,B相为0.2%甲酸水溶液,梯度洗脱(见表1);柱温:40℃;进样量:10L。

  由于仪器厂家不同,质谱各参数也不一致,其参考条件如下。离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测;毛细管电压、碰撞能量等参数应优化至最佳灵敏度;定性离子对、定量离子对等参数见表2。

  准确移取VA、VD3、VE标准溶液适量,分别加入6份空白样品中。经提取、净化及浓缩后,加甲醇溶液定容,充分混匀,制得浓度为0.1IU/L、0.5IU/L、1.0IU/L、5.0IU/L、20.0IU/L、100IU/L的基质匹配标准工作液,现用现配。

  选择典型的饲料原料,包括玉米面、米糠、小麦麸、棉粕,回收结果为80%~110%。回收试验表明,该方法定量检测对饲料原料均有较好的适用性(见表3)。

  对米面、米糠、小麦麸、棉粕4种植物性饲料原料进行了检测。4种植物性饲料原料中维生素E的含量较高,其中,米糠的含量最高,达到了39.88IU/kg;小麦粉次之,达到了20.25IU/kg;棉粕的含量最低,为3.354IU/kg。4种植物性的饲料原料中VA、VD3均未检出,检测结果见表4。

  农业部2625号公告给出配合饲料中VE推荐添加量。由表4可知,如果配合饲料中添加一定比例的米糠、小麦粉等饲料原料,饲料配方设计中外源性VE添加量为饲料配方设计的VE理论添加量减去饲料原料中VE含量,且外源性VE的添加量会一定程度地减少。在饲料生产实践过程中节约了VE的添加成本,提高了饲料加工生产效益。

  2.2 皂化过程对VA、VD3、VE有一定的破坏作用,因此,要用经过皂化反应的VA、VD3、VE的对照品来定量。

  2.3要注意基质效应,饲料原料中VA、VD3、VE的检测是有一定的基质效应的,因此要充分考虑样品的基质效应,饲料原料基质效应见表6。

  维生素A的浓度与峰面积的相关系数为0.9998,维生素D3的浓度与峰面积的相关系数为0.9999,维生素E的浓度与峰面积的相关系数为0.9995。方法定量限为0.5IU/kg,方法检出限为0.1IU/kg。相对偏差小于20%。回收率在80%~110%。回收试验表明,该方法适合饲料原料中维生素A、维生素D3、维生素E的检测。

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